Trotz der Repressionen erlebte das Seminar zunächst einen starken Zulauf. Die Zahl der Priesteramtskandidaten stieg ab 1933 rasant: Von 104 im Studienjahr 1931/32 auf 196 im Jahr 1937/38. Die Hörerzahlen an der Hochschule explodierten: Von 108 im Studienjahr 1932/33 auf 621 im Jahr 1939/40. Grund war die Schließung nahezu aller anderen theologischen Bildungseinrichtungen in Süddeutschland durch das NS-Regime. Eichstätt war der letzte verbliebene Ort für die Priesterausbildung. „Das stille Altmühlstädtchen wurde über Nacht zu einem Zentrum der süddeutschen Theologen“, schreibt Andreas Bauch. Doch auch die Kapazitäten des Seminars reichten bald nicht mehr aus. Außer 41 Pfälzern wohnten im Hause 110 Priesteramtskandidaten aus der Erzdiözese München-Freising, 89 aus der Diözese Regensburg und 58 aus der Diözese Passau. Im Kapuzinerkloster lebten 47 Alumnen aus dem Erzbistum Bamberg, 49 Theologen aus der Diözese Rothenburg-Stuttgart wohnten im Institut der Englischen Fräulein (Maria-Ward). Alle übrigen mussten in Privathaushalten unterkommen.
Mit Kriegsbeginn änderte sich die Lage schlagartig: Einberufungen reduzierten die Zahl der Theologiestudenten. 1940/41 waren es noch 238, 1942/43 nur noch 22 schwerverwundete oder kriegsuntaugliche Alumnen (neben 112 Seminaristen im Knabenseminar). 1944/45 lebten wieder 136 Studierende im Haus, unter ihnen 100 litauische Theologen, die vor der Roten Armee geflohen waren. Bereits 1941 hatte die Hochschule ihren öffentlich-rechtlichen Status verloren; die Diözese trug daraufhin bis 1946 die Personalkosten allein.
Lazarett und überfüllte Keller
Ab Kriegsbeginn beschlagnahmte das NS-Regime mehrere Gebäude des Priesterseminars. Im sogenannten Kasinogebäude waren zeitweise Soldaten und Polizisten einquartiert; von 1942 bis 1945 lebten dort rund 160 Kinder, die aus Luftkriegsgebieten evakuiert worden waren. Den Trakt, in dem sich heute das Collegium Orientale befindet, beanspruchte die Wehrmacht, zunächst zur Unterbringung einer Wachkompanie, später als Reservelazarett. Am 1. März 1944 trafen die ersten 120 Verwundeten ein. Holzverschalungen trennten das Lazarett vom Priester- und Knabenseminar.
Ab Anfang 1945 verschärften sich die Einschränkungen dramatisch: Strom, Gas, Telefon, Post und Verkehr waren rationiert, Brot wurde knapp. In den letzten Kriegswochen suchten viele Eichstätter im Keller des Seminars Schutz vor Luftangriffen. Rote-Kreuz-Flaggen am Gebäude und im Garten sollten Verwundete schützen. Am 25. April 1945 rückten amerikanische Truppen kampflos in Eichstätt ein, der Krieg endete.
Eichstätt blieb weitgehend unzerstört. Das Seminar hatte überlebt, aber hohe Verluste erlitten. Zwischen 1939 und 1945 fielen laut Andreas Bauch 269 Theologen, 70 gelten als vermisst, „sodass die Verlustziffer 339 Tote umfasst“. Aus der Diözese Eichstätt wurden 135 Alumnen eingezogen: 30 starben, fünf gelten als vermisst, weitere 30 wechselten während des Krieges den Beruf. Bauch resümiert: „Das Studium der mehr als 1000 Personalakten der Kriegstheologen im Seminararchiv wird zu einem überzeugenden Beweis für den religiösen Glauben, die echte Vaterlandsliebe, aber auch für das gesunde Urteilsvermögen einer Jugend, von welcher ein verbrecherisches System das Leben forderte, der jedoch ihr Glaube nicht geraubt werden konnte.“